Was ist LC-MS?
Die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) kombiniert zwei leistungsstarke Analysetechniken: Flüssigchromatographie (LC) und Massenspektrometrie (MS).
- Flüssigchromatographie (LC) trennt die Komponenten in einer Probe auf der Grundlage ihrer chemischen Eigenschaften, wie Polarität oder Größe. Dadurch wird sichergestellt, dass der interessierende Analyt vor der MS-Analyse von potenziellen Störfaktoren isoliert wird.
- Massenspektrometrie (MS) identifiziert und quantifiziert dann die getrennten Moleküle durch Messung ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z). MS liefert hochpräzise Molekulargewichte, Strukturinformationen und Einblicke in Modifikationen, z. B. posttranslationale Proteinveränderungen.
Kombiniert liefert LC-MS ein Maß an Präzision und hochauflösender Analyse, das auf dem Gebiet der Biomolekülanalyse beispiellos ist und es zu einem Eckpfeiler der Qualitätskontrolle in der Biotechnologie macht.
Warum ist sie für die Herstellung von Biotherapeutika so wichtig?
Biotherapeutika sind hochkomplexe Moleküle, die genau charakterisiert werden müssen, um Sicherheit, Wirksamkeit und Konsistenz zu gewährleisten. Die Massenspektrometrie ermöglicht den Herstellern die:
- Charakterisierung struktureller Details: Identifizierung der Primärstruktur, posttranslationaler Modifikationen (PTMs) und Strukturen höherer Ordnung. Bei der Herstellung monoklonaler Antikörper wird MS beispielsweise zur Bestätigung der Aminosäuresequenz und zur Identifizierung kritischer posttranslationaler Modifikationen (PTM) wie Glykosylierung oder Oxidation eingesetzt, die die Stabilität und Wirksamkeit von Medikamenten beeinträchtigen können. Die Strukturanalyse höherer Ordnung mit MS hilft sicherzustellen, dass die Proteinfaltung mit der therapeutischen Aktivität übereinstimmt.
- Überwachung der Prozesskonsistenz: Bei der Herstellung rekombinanter Proteine wie Erythropoietin verfolgt MS kritische Qualitätsmerkmale (CQAs) wie Isoformverteilung und Glykoform-Verhältnisse, um die Einheitlichkeit der Chargen zu gewährleisten. Dies ist für die Aufrechterhaltung konsistenter therapeutischer Ergebnisse bei den Patienten unerlässlich.
- Erkennung von Verunreinigungen: MS kann Wirtszellproteine oder Aggregate in Biologika empfindlich erkennen, z.B. bei der Reinigung von Impfstoffen, wo selbst Spuren von Verunreinigungen zu unerwünschten Immunreaktionen führen können.
Durch die Bereitstellung präziser Daten während des gesamten Herstellungsprozesses unterstützt MS die Hersteller von Biotherapeutika bei der Einhaltung gesetzlicher Vorschriften und der Lieferung hochwertiger Produkte.
Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung ist ein entscheidender Schritt bei der MS und wirkt sich direkt auf die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Qualität der Ergebnisse aus. Sie stellt sicher, dass die Probe mit den MS-Arbeitsabläufen kompatibel und frei von Interferenzen ist, die die Ionisierung oder die Datenqualität beeinträchtigen könnten.
Warum ist die Probenvorbereitung wichtig?
Genaue und zuverlässige MS-Ergebnisse hängen von einer effektiven Probenvorbereitung zur Isolierung, Reinigung und Verarbeitung von Biomolekülen ab. Bei Proteinen gewährleistet die Probenvorbereitung die Kompatibilität mit LC-MS-Arbeitsabläufen und bestimmt, wie viel Struktur- und Zusammensetzungsinformation erhalten bleibt.
Bottom-up-Probenvorbereitung für LC-MS
Der Bottom-up-Ansatz ist die am häufigsten verwendete Methode für die Proteinanalyse in LC-MS-Arbeitsabläufen. Sie beinhaltet den enzymatischen Verdau von Proteinen in kleinere Peptide vor der Analyse. Diese Methode ist zwar gut etabliert und liefert detaillierte Sequenzinformationen, weist aber auch erhebliche Einschränkungen auf:
- Verlust von Informationen: Durch die Zerlegung von Proteinen in Peptide gehen wichtige Informationen über intakte Protein-Isoformen und Strukturen höherer Ordnung, wie Faltung oder Aggregation, verloren.
- Zeitintensive Verfahren: Bottom-up-Workflows umfassen mehrere Vorbereitungsschritte, einschließlich enzymatischer Verdauung, die arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein können.
Aufgrund dieser Einschränkungen ist die Bottom-up-Probenvorbereitung für bestimmte Anwendungen weniger geeignet, insbesondere wenn die Erhaltung der Proteinintegrität entscheidend ist.
Top-down-Probenvorbereitung für LC-MS
Die Top-down-Probenvorbereitung bietet einen rationaleren und informativeren Ansatz für die LC-MS-Analyse. Bei dieser Methode werden intakte Proteine ohne enzymatischen Verdau analysiert, so dass ihre vollständige Struktur erhalten bleibt. Dieser Ansatz behebt viele Einschränkungen der Bottom-up-Workflows:
- Zeitersparnis: Top-Down-Workflows machen den enzymatischen Aufschluss überflüssig, was die Vorbereitungszeit erheblich verkürzt.
- Umfassende Informationen: Bei der Analyse intakter Proteine bleiben strukturelle Details höherer Ordnung erhalten, so dass sich ein vollständigeres Bild des Biomoleküls ergibt.
Bei der Analyse von rekombinantem Insulin kann die Top-Down-LC-MS beispielsweise Isoformen identifizieren und charakterisieren, die während der Herstellung entstehen könnten, und so Einblicke in die Proteinstabilität und die therapeutische Leistung liefern.
Die Top-down-Probenvorbereitung hat jedoch ihre Grenzen. Sie eignet sich am besten für kleine bis mittelgroße Proteine, da die Handhabung größerer Biomoleküle aufgrund von Gerätebeschränkungen und der Komplexität der Proben eine größere Herausforderung darstellen kann.
Wichtige Überlegungen zur Probenvorbereitung
- Pufferkompatibilität: Die Puffer müssen die MS-Ionisierung unterstützen und Störungen vermeiden. Zu den üblicherweise verwendeten flüchtigen Puffern gehören Ammoniumacetat und Ammoniumformiat.
- Entfernung von Reinigungsmitteln: Reinigungsmittel können MS-Signale unterdrücken, weshalb wirksame Reinigungstechniken unerlässlich sind.
- Automatisierung: Automatisierte Probenvorbereitungssysteme verringern menschliche Fehler und erhöhen die Konsistenz, insbesondere bei komplexen Arbeitsabläufen.
Die Zukunft der Massenspektrometrie in der Bioproduktion
Die Massenspektrometrie ist ein Eckpfeiler der Biotherapeutika und ermöglicht eine umfassende Qualitätskontrolle und strukturelle Charakterisierung, die die Sicherheit und Wirksamkeit neuartiger Therapien gewährleistet. Bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern beispielsweise erkennt die MS subtile Variationen in den Glykosylierungsmustern, die die Wirksamkeit des Medikaments beeinträchtigen könnten. Auch bei der Entwicklung von Impfstoffen spielt die MS eine entscheidende Rolle, da sie durch die Überwachung wichtiger Qualitätsmerkmale wie Proteinstruktur und -aggregation die Konsistenz zwischen den einzelnen Chargen gewährleistet.
Eine schnelle und effiziente Probenvorbereitung ist für den Erfolg sowohl von Bottom-up- als auch von Top-down-LC-MS-Workflows unerlässlich. Bei der Bottom-up-LC-MS ist die Optimierung des enzymatischen Verdaus entscheidend, um die Vorbereitungszeit zu verkürzen und gleichzeitig die Peptidausbeute und Sequenzabdeckung zu erhalten. Im Gegensatz dazu steht die Top-Down-LC-MS vor größeren Herausforderungen, da die Aufreinigung intakter Proteine von zentraler Bedeutung ist. Wenn sichergestellt wird, dass die Proben nach der Reinigung in einem kompatiblen Puffersystem verbleiben, entfällt die Notwendigkeit eines zusätzlichen Pufferaustauschs, was Datenverluste verhindert und die Integrität der Proteine bewahrt.
Top-down-LC-MS ist besonders effektiv für die Analyse intakter Proteine, wie z. B. rekombinantes Insulin, bei dem die Identifizierung von Isoformen die therapeutischen Ergebnisse erheblich beeinflussen kann. Um die anspruchsvollen Anforderungen dieser Arbeitsabläufe zu erfüllen, werden automatisierte Systeme entwickelt, die die Probenvorbereitung rationalisieren und die Reproduzierbarkeit verbessern. In diesem Zusammenhang bietet unsere Technologie der Digitalen Membranchromatographie (DMC) in Verbindung mit modernen Membranen eine ideale Lösung. Die Proben sind sofort für die MS-Analyse bereit, da die DMC in einem einzigen Puffersystem arbeitet, was eine direkte Kompatibilität mit dem Puffer ermöglicht und den sofortigen Einsatz erlaubt. Diese Innovationen reduzieren die Vorbereitungszeit, minimieren Fehler und gewährleisten, dass die Proben sofort für die LC-MS-Analyse bereit sind.